Microscopia elettronica a trasmissione (TEM): perché è importante il glow discharge?
Che cos’è la microscopia elettronica?
La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è un metodo di imaging ad alta risoluzione che fornisce informazioni sulla morfologia e la struttura dei campioni. Per penetrarli, questa utilizza un fascio di elettroni ad alta energia e riproduce le immagini utilizzando la parte trasmessa del fascio.
Poiché gli elettroni altamente accelerati hanno una piccola lunghezza d’onda, possono essere impiegati per risolvere piccole anomalie del campione. Questa capacità è fondamentale negli studi di:
• nanotecnologia
• biologia strutturale
• scienze dei materiali.
Come funziona?
Il campione da acquisire deve essere posizionato su una speciale griglia metallica, solitamente ricoperta da un supporto in polimero o carbonio ultrasottile (2-5 nm, formvar, pioloform, carbonio) precedentemente trattata da processo di glow discharge per garantire che il supporto della superficie sia adatto all’uso.
Come mostrato in Figura 1, anche gli strati di carbonio appena preparati per le griglie TEM avranno legati componenti indesiderati come acqua e materiale a basso peso molecolare sulla superficie, tipicamente assorbiti dall’aria.
Fondamentale è che questi contaminanti vengano rimossi con il glow discharge prima di utilizzare le griglie, per garantire la migliore adesione del campione. Inoltre, lo strato di carbonio depositato sulla griglia ha una superficie a carica variabile che è solitamente idrofoba, quindi anche la diffusione della sospensione del campione a base acquosa è molto difficile, come illustrato nella Figura 2.
Che cos’è il glow discharge?
Il “plasma glow discharge” è un gas a bassa pressione parzialmente ionizzato. È costituito da ioni di carica netta positiva e negativa. Questo stato quasi neutro è sostenuto dalla presenza di elettroni energetici che, entrando in collisione in maniera non elastica con molecole di gas, vengono eccitati e ionizzati, formando radicali liberi e ioni di molecole di gas.
Il caratteristico bagliore osservato durante tale processo è causato dai fotoni che vengono rilasciati dai radicali liberi neutralizzati (è il cosiddetto “rilassamento degli elettroni”). Il glow discharge è una tecnica utile per la pulizia e la modifica delle superfici e il suo risultato finale dipende dal gas plasma scelto e dalla polarità (Figura 3).
Perché non può esistere un solo glow discharge?
Fra tutti i materiali, i campioni biologici sono i più difficili da preparare. Il processo può consistere in diversi passaggi ugualmente importanti e il fallimento di uno di questi può portare alla completa perdita del campione. Inoltre, a causa della loro specifica carica locale, l’affinità della molecola con i supporti TEM potrebbe essere diversa. Questo può essere particolarmente evidente nelle proteine, dove parti specifiche della molecola si caricano in modo diverso.
I vantaggi di un buon glow discharge
Un’adeguata preparazione delle griglie TEM ha notevoli vantaggi:
• permetterà la diffusione uniforme del campione
• aumenterà il numero di molecole trattenute
• consentirà di orientare le molecole sul supporto TEM per rivelare le aree di interesse.
Come scegliere il giusto metodo di glow discharge?
L’effetto desiderato del glow discharge è quello di rendere la superficie del supporto in carbonio della griglia TEM opportunamente modificata e sufficientemente caricata per l’applicazione. Di conseguenza, un sottile film liquido in cui è sospeso il campione si diffonderà uniformemente e si asciugherà su tutta la superficie. La tabella seguente mostra esempi di possibili modifiche della superficie insieme alle loro applicazioni.
Vantaggi di un sistema a due camere
Come sempre in laboratorio, anche nel glow discharge affidarsi alla giusta strumentazione è il primo passo per risultati chiari e ripetibili.
Un sistema compatto a due camere (Figura 5, GloQube® Plus,) è un modo veloce ed efficiente per provare diversi tipi di modifiche della superficie. Questo è l’ideale se la più comune glow discharge in aria non produce i risultati desiderati.
Un sistema a singola camera non è infatti facile o affidabile da usare come un sistema a doppia camera quando è richiesto un glow discharge con vapore chimico. Ciò è dovuto ai contaminanti chimici depositati durante il processo, che devono essere rimossi completamente pulendo la camera e il sistema per il trattamento al plasma in aria.
Quando si utilizzano le camere separatamente, il sistema GloQube® Plus impedisce infatti la contaminazione incrociata utilizzando le due camere, evitando così i tempi di inattività dello strumento. Un ciclo con pompa di spurgo appositamente progettato rimuove tutti i residui di vapori chimici utilizzati nel sistema.
Conclusione
Come abbiamo detto, l’uso di una camera separata per il glow discharge in aria o vapore è essenziale per eliminare il rischio di contaminazione incrociata.
L’utilizzo di uno strumento per il glow discharge con due camere per aria/vapore chimico come il GloQube® Plus fornisce tutte le funzionalità necessarie per la preparazione delle griglie TEM. Il design GloQube® Plus non solo garantisce che non si verifichino contaminazioni incrociate, ma consente all’utente di eseguire processi in sequenza utilizzando lo stesso prodotto chimico, senza la necessità di pulizia dello strumento.
